细胞焦亡基因构建预后模型，发表7分+SCI！
导语
细胞焦亡在胰腺癌中的作用仍然未知。
背景介绍
今天小编为大家带来一篇细胞焦亡构建预后模型+实验验证发表高分文章的例子。文章发表在Journal of Translational Medicine，题目为Systemanalysis based on the pyroptosis-related genes identifies GSDMC as a novel therapy target for pancreatic adenocarcinoma。
研究设计
数据介绍
从TCGA和GTEx获取178个胰腺癌样本和167个正常胰腺样本的RNA-seq数据及其临床病理参数。GEO数据（GSE71729和GSE57495）包括186个胰腺癌样本的RNA-seq数据和临床病理学特征。
结果解析
01胰腺癌中差异表达的细胞焦亡基因
使用R包“DESeq2”，根据|log2|>1.2和FDR<0.05的标准，鉴定出25个差异表达的细胞焦亡相关基因。其中，16个基因显著下调，而9个基因显著上调（图2A，C，D）。这些差异表达的细胞焦亡相关基因的PPI网络如图2B所示。此外，在这些差异表达的细胞焦亡基因中观察到胰腺癌患者的许多突变（图2E）。
02功能富集
GO富集分析表明，这些差异表达的焦亡相关基因主要与细胞因子产生的正式调节和对细菌的防御反应有关。KEGG的分析显示，这些差异表达的凋亡相关基因参与铂类耐药性，多物种凋亡，ERbB信号通路和细胞凋亡。这表明这些与细胞焦亡相关的基因参与除细胞焦亡以外的其他生物过程。
03构建预后模型
使用单变量Cox回归分析筛选出9个P<0.05的细胞焦亡相关基因，包括5个潜在风险基因（IL18，GSDMC，NLRP2，CASP8和CASP4）和4个潜在的保护基因（PLCG1，GPX4，PRKACA和NLRP1）。
作者在单变量Cox回归的基础上，进行LASSO回归分析（图 3C，D）。利用IL18、CASP4、NLRP1、NLRP2和GSDMC构建了预后模型。最后，作者进行了多变量Cox回归分析，鉴定出3个与胰腺癌相关的基因，其中2个是潜在风险基因，1个是潜在的保护基因（图3B）。
风险评分=IL18×0.002067+GSDMC×0.034755+NLRP2×0.028693+PLCG1×（−0.00285）+NLRP1×（−0.05665）+CASP4×0.036385。
为了确认该细胞焦亡模型是否可以预测PAAD患者的预后，作者根据中位风险评分的阈值将170名患者分为高危组（n = 85）和低风险组（n = 85）（图4A）。与低危组相比，高危组的死亡率更高，生存时间更短。得分越高，PAAD患者的预后越差（图4C）。IL18、CASP4、GSDMC 和 NLRP2 在高危组中高度表达，NLRP1 在高风险组中表达低（图4D）。
Kaplan Meier曲线显示，高危组患者的预后较差（图4B）。时间依赖性ROC分析显示，OS在1年时的预后准确性为0.673，3年时为0.768，5年时为0.790（图4E）。综上，模型中与细胞焦亡相关的基因特征有助于预测PAAD预后。
04验证预后模型
为了验证预后模型的准确性，从GEO获得了186名胰腺癌患者，并使用训练集中的相同公式计算了风险评分。根据风险评分的中值，GEO队列中的99名患者被分为低风险组，87名患者被分为高危组。低危组患者的生存时间比高危组长。IL18、CASP4、GSDMC 和 NLRP2 在高危组中高度表达，NLRP1 在高风险组中表达较少。
Kaplan Meier分析表明，低危组和高危组的存活率差异显著，这与训练集中的结果一致。时间依赖性 ROC 分析显示，OS在1年时的预后准确率为0.590，3年时为 0.554，5年时为0.658。模型在预测测试集中的预后方面具有可接受的准确性。
05风险评分与临床特征
为了验证风险评分和临床特征是否可以作为独立的预后因素，作者进行了单变量和多变量的预后分析。单变量独立预后分析结果显示，年龄、N期和风险评分与PAAD患者的OS显著相关。多变量独立预后分析表明，风险评分是一个独立的预测因子。
此外，作者评估了细胞焦亡相关基因的表达与临床特征之间的关系。结果显示NLRP1与 N ， T 等级呈负相关。NLRP2与等级呈正相关。GSDMC与分期呈负相关。CASP4与等级呈正相关。风险评分与等级呈正相关。综上，该模型是一个可靠的预后生物标志物。
06列线图和校准曲线
为了提供更好的定量方法来预测PAAD患者的预后，建立了一个结合年龄，性别，N，T和风险评分的列线图。列线图显示，风险评分是各种临床参数中的重要因素（图5A）。校准曲线表明列线图与PAAD患者的实际生存率非常匹配（图5B–D）。与传统的预后评分系统相比，该模型具有更高的AUC值（AUC = 0.664，图5E）。综上，该列线图可用于准确预测PAAD患者的OS。
07GSEA富集
作者分别在训练集和验证集中的高风险组和低风险组之间进行了GSEA富集分析。在训练集中，高危组的富集途径包括细胞凋亡、紧密连接、剪接体、轴突引导和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。低危组的主要富集途径是神经活性配体受体相互作用、味觉转导、自身免疫性甲状腺疾病、趋化因子信号通路、局灶性粘附。
在验证集中，高危组的主要富集途径包括蛋白酶体、糖基磷脂酰肌醇GPI锚定生物合成、核苷酸切除修复、氨基酰基tRNA生物合成和DNA复制，而在低危组中，主要富集途径为心肌收缩、长期抑制、血管平滑肌收缩、钙信号通路和肌萎缩性侧索硬化症。
08药物敏感性
为了预测对化疗的反应，作者使用pRRophetic算法根据PAAD患者癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库中可用的半最大值抑制浓度（IC50）来估计化疗反应。在高危组和低风险组之间共鉴定出49种反应明显不同的小分子化合物。
前四种小分子化合物在高风险组和低风险组之间的P值最低，包括A.443654（图6A），PD.173074（图6C），Epothilone.B（图6E），拉帕替尼（图6G）。高危组PAAD患者对A.443654、埃坡霉素、拉帕替尼敏感度较高，低危组患者对PD.173074敏感度更高。然后通过PubChem网站可视化这4种小分子化合物的3D构象（图6B，D，F，H）。这些小分子化合物可能是PAAD潜在的分子化疗化合物。
09免疫浸润
将免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分相结合，分析这些评分与风险评分的关联。结果显示，风险评分与免疫评分（P=0.0071），基质评分（P=0.0024）和ESTIMATE评分（P=0.0019，图7A–C）显著相关。
使用CIBERSORT算法计算PAAD患者中22种免疫细胞亚型的比例，并将P值<0.05的阈值视为临界标准（图7D）。高危组B细胞记忆、巨噬细胞M1和肥大细胞静息的浸润水平均高于低危组。然而，低危组活化的B细胞幼稚细胞、T细胞CD8、单核细胞和肥大细胞的浸润水平高于高危组（图7E）。
此外，作者评估了风险评分与五个免疫细胞之间的相关性。T细胞CD8，单核细胞和朴素B细胞与风险评分呈正相关，而巨噬细胞M1和B细胞记忆与风险评分呈负相关。
10K-M图
作者绘制了Kaplan-Meier图测试焦亡相关基因的表达是否与PAAD的预后相关。结果表明，NLRP1表达量高的PAAD患者预后较好，而NLRP2、GSDMC、IL18和CASP4表达量低的PAAD患者预后较好。
11敲低GSDMC抑制胰腺癌细胞增殖和迁移
为了研究GSDMC在PAAD细胞中的作用，作者设计了两种siRNA（GSDMC-1、GSDMC-2）来沉默PANC-1和CFPAC-1细胞中GSDMC的表达。结果表明，敲低GSDMC的表达可以抑制PAAD中的细胞增殖，迁移和侵袭。
此外，为了测试细胞增殖和迁移的抑制是否是由敲低GSDMC引起的，作者使用慢病毒系统在PANC-1和CFPAC-1细胞中重新表达GSDMC。结果表明，GSDMC沉默后，恢复GSDMC可以挽救细胞增殖、迁移和侵袭的抑制。
小编总结
本文开篇是常规的构建肿瘤预后模型文章，作者首先鉴定了细胞焦亡相关基因中在胰腺癌和正常样本中差异表达的基因，并使用cox回归和lasso回归筛选出显著的风险基因和保护基因，基于此构建了风险模型。作者接下来对模型性能进行了验证，又调查了临床特征、免疫浸润、预后、富集等方面。最后，作者重点关注了GSDMC，并进行了生物学实验验证。
原文转自：作图丫(ID:biomining)