20160405 illumina 测序原理介绍
目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升。
其实，二代测序比较常见的有罗氏454测序，Illumina等。但目前最为常用的NGS技术就是illumina测序技术，它能够保证在几十个小时内产生几百G甚至上T的测序数据，完全能够满足高通量测序的通量要求。并且其测序准确程度也是完全能够保证。我在这里很决断的说，在目前高通量测序的科研领域，Illumina测序绝对是主导地位的，几乎没有其他的公司可以撼动它。因此，我们这篇文章就Illumina测序的原理做一个比较详细的介绍，希望对大家入门生物信息学有所帮助。
目录
- 一些常用基本概念的介绍
- 建库
- 桥式PCR
- 测序 & Illumina为什么这么短！
- 下期预告
一些常用基本概念的介绍：
- flowcell 是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane
- lane 每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等
- tile 每一次测序荧光扫描的最小单位
- reads 指测序的结果，1条序列一般称为1条reads
- bp base pair 碱基对，用于衡量序列长度
- 双端测序 只一条序列可能比较长如500bp，我们可以两端每端各测150bp
- junction 上面说的双端测序，中间会留有200bp测不到的东西，我们叫junction
- adapter 就是测序中需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能
- primer PCR中的引物
下图就是一台illumina最新的X Ten测序仪。
下图就是flowcell，图中黑色小线条中间的空白就是lane，每一个lane中整齐排列了无数个tile，只可惜我们肉眼看不到。
图片引用： http://41j.com/blog/2012/04/nextgen-sequencing-primer/
下面开始正式介绍测序反应
1.建库
- 由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten也就是双端各150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，所以在测序的时候需要先打断成一定长度的片段，这个根据需要用不同的策略，一般测人的基因组，我们是将其打断成300 ~ 500bp的长度。这个是根据跑胶控制的。
- 打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。
- 完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A
- 加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter，这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列
- 进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。
- 建库的示意图如下图所示，引用自 http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq
2.桥式PCR
- 将上述的DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell中，再加入特异的化学试剂，就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连，如下图。图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater，分别对应序列之前加入的两种adpater
- 引用： https://i.ytimg.com/vi/t0akxx8Dwsk/maxresdefault.jpg
- 连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。由于最开始的序列是使用化学键连接的，所以不会被洗。
- 加入缓冲溶液，这时候序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配
- 进行一轮PCR，在PCR的过程中，序列是弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍
- 如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫cluster
整体流程如下图所示：
引用自： http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq
- 形成这种1个cluster，1个cluster的形态，在整个flowcell中看上去，示意图如下。其中的每1个cluster就算是1群完全相同的序列。
引用自： http://www.intechopen.com/source/html/49419/media/image2.png
3.测序
- 测序的过程反而简单了不少。就是来一个primer，然后加入特殊处理过的A，T，C，G四种碱基。特殊的地方有两点，一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证每次只能够在序列上添加1个碱基；另一方面是，碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色。
- 特殊处理的脱氧核糖核酸，引用自： http://www.oezratty.net/，图中的核糖的羟基应该换成-N2的叠氮基团。
- 在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。一个测序扫描图片如下：
- 随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。如此往复，就可以测出序列的内容。示意图如下，引用自 http://www.gendx.com/：
- 那为什么Illumina测序会有长度限制呢？主要是下面2点
- 测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。通俗一点讲，比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，50个绿色，这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成。
- 测序过程中，使用的碱基是特殊处理的，有一个非常大的荧光基团修饰。在使用DNA ploymerase的时候，酶的状态也会受到底物的影响，越来越差。
到此，Illumina测序的相关内容就介绍差不多了。
最后，如果大家觉得文字比较单薄，还可以参考下面这个链接，讲解得也十分详细。测序原理视频： Illumina测序原理
下期预告：在测序完成以后，我们怎么有效地储存数据？常用的有FASTA和FASTQ两种格式，在下期文章中我会对储存格式进行一个比较详细地说明。
短期规划：介绍储存格式 -> 序列比对 双序列比对 / 多序列比对 -> bowtie2, BWA -> samtools -> 用1组真实数据，手把手教你分析高通量测序结果 -> cufflink -> RNA seq 分析
如果各位有什么特别想要提前知道的，或者想讨论的技术，可以私信给我，我会尽早安排写作。尽量保证1周1到2篇的更新速度。
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1. 知乎Live： 如何快速入门生物信息学
（涉及内容：测序原理，生物信息学发展历史，软件的安装与调试，入门路线图，介绍了RNA-Seq的分析流程并给出实践代码）；
2. 知乎Live: 生信进阶第1课-重复Nature文章
(涉及内容：肺癌相关研究现状，RNA-Seq单细胞测序，RNA-Seq的建库方法，RNA-Seq的分析流程细节，相关生信图的绘制）；
3. 知乎Live： 生信进阶第2课-基因组序列
(涉及内容：介绍基因组的序列结构，hg19与hg38的区别，ENCODE计划，常用的表观组学实验原理ChIP-Seq，Hi-C等，ChIP-Seq的标准处理流程，绘图原理)
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(涉及内容：介绍生物信息学入门的几个层次，从命令行到图形界面再到命令行，绘制生物进化树，图形界面分析平台，使用图形界面处理RNA-Seq数据，使用图形界面分析ChIP-Seq数据，UCSC genome browser，WashU genome browser)
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