一种检测多种白血病融合基因的数字PCR试剂盒的制作方法

一种检测多种白血病融合基因的数字pcr试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种检测多种白血病融合基因的数字pcr试剂盒。


背景技术：

2.在细胞分裂及其它生命周期，染色体可能发生不正常的易位，可能造成基因的“错误拼接”，形成融合基因。“错误拼接”的基因会导致原有表达功能异常，出现细胞加速增殖、分化障碍、加速凋亡等。融合基因常见于白血病相关的特异性标志中，大部分白血病患者存在基因染色体异常。因此，相关融合基因的检测对于白血病的诊断、疗效、预后评估有重要意义。
3.aml1-eto是急性髓性白血病(aml)中最常见的染色体易位融合蛋白因。在其中，造血转录因子aml1的“dna-结合域”被融合到eto蛋白的四个保守域(nhr1 4)中，这样所形成的组合蛋白与基因抑制和激发都有关。
4.bcr-abl1融合基因是慢性髓系细胞白血病(cml)发病机制的必要条件。在高达95％的cml病例中，有t(9；22)(q34；q11)染色体易位导致bcr-abl1融合基因的现象。abl1是一种酪氨酸激酶；在正常细胞中，它在细胞分化和细胞周期调控方面发挥重要作用。bcr-abl1融合基因导致酪氨酸激酶的组成性激活，从而导致不受控制的细胞增殖。
5.cbfb-myh11融合基因是染色体重排的结果，与m4型aml的发生密切相关。cbfb-myh11融合基因较常见类型为inv(16)(p13.1q22)，较少见的类型为t(16；16)(p13.1；q22)。小鼠模型表明，cbfb-myh11融合基因可以破坏核心结合因子(cbf)的功能，导致髓系分化阻断并最终导致白血病。
6.pml/rara融合基因是急性早幼粒细胞白血病(apl)的一个特异分子标志,其由15号染色体上的pml基因与17号染色体上的rara基因发生相互易位而形成，目前发现约95％的apl患者伴有t(15；17)(q22；q21)异常染色体核型，pml/rara融合蛋白通过抑制早幼粒细胞分化成熟，从而导致细胞持续增殖。
7.现有的白血病检测常用的方案是采用荧光定量pcr技术或者是fish技术。传统技术fish检测对于操作和判读技术要求较高，检测的成本也高且耗时长。临床上会出现一些微小的白血病融合基因残留，例如慢性粒细胞性白血病的bcr-abl1融合基因，其停药的标准是0.0032％，也就是10万个abl1分子中含有少于32个bcr-abl1，fish技术和rt-qpcr难以在高背景下检测如此微量的阳性。荧光定量pcr技术对于定性比较容易，但是涉及到定量，往往需要做包括内参和检测靶点单重的一系列的标准曲线，操作繁琐。此外，样品的数量有限，需要在一个样品里对多种标志分子进行绝对定量，rt-qpcr难以实现。目前市场上常用于白血病融合基因检测的多为rt-qpcr技术，但是其越发不能满足人们的需求，因此需要进一步研发新的白血病检测技术。
8.数字pcr是一种新的pcr技术，适用于微量模板的绝对定量。但是多重数字pcr反应对检测体系中引物探针组合的要求很高，其影响因素较多，比如：(1)反应体系不平衡，反应
体系的不平衡容易导致在前期的反应中某些优势引物的模板迅速扩增，优势产物将抑制dna聚合酶的活性。劣势扩增的引物和模板的扩增反应会变得非常困难，以至于无法检测。(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
9.到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。数字pcr的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。目前尚未有能直接同时对ml1-eto、bcr-abl1、cbfb-myh11和pml-rara融合基因及其亚型进行绝对定量的多重pcr技术的报导。


技术实现要素：

10.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于同时检测多种白血病融合基因的数字pcr检测试剂盒。
11.本发明提供了检测aml1-eto融合基因的探针和引物组合，其包括：
12.aml1-eto基因的正向引物ae-f，其序列如seq:idno1所示；
13.aml1-eto基因的反向引物ae-r，其序列如seq:idno2所示；
14.aml1-eto基因的探针ae-p，其序列如seq:idno3所示。
15.本发明还提供了检测bcr-abl1融合基因的探针和引物组合，其包括：
16.bcr-abl1基因p190亚型的正向引物p190-f，其序列如seq:idno4所示；
17.bcr-abl1基因p210亚型的正向引物p210-f，其序列如seq:idno5所示；
18.bcr-abl1基因p230亚型的正向引物p230-f，其序列如seq:idno6所示；
19.bcr-abl1基因的通用反向引物abl1-r，其序列如seq:idno7所示；bcr-abl1基因的通用探针abl1-p，其序列如seq:idno8所示。
20.本发明还提供了检测cbfb-myh11融合基因的探针和引物组合，其包括：
21.cbfb-myh11基因的通用正向引物cbfb-f，其序列如seq:idno9所示；
22.cbfb-myh11a亚型基因的反向引物a-r，其序列如seq:idno10所示；
23.cbfb-myh11d亚型基因的反向引物d-r，其序列如seq:idno11所示；
24.cbfb-myh11基因的通用探针cbfb-p，其序列如seq:idno12所示。
25.本发明还提供了检测pml-rara融合基因的探针和引物组合，其包括：
26.pml-raral亚型基因的正向引物l-f，其序列如seq:idno13所示；
27.pml-raras亚型基因的正向引物s-f，其序列如seq:idno14所示；
28.pml-rarav亚型基因的正向引物v-f，其序列如seq:idno15所示；
29.pml-rara基因的通用反向引物rara-r，其序列如seq:idno16所示；
30.pml-rara基因的通用探针rara-p，其序列如seq:idno16所示。
31.本发明还提供了一种基于数字pcr检测多种白血病融合基因的引物探针组合，其特征在于，其包括所述的aml1-eto、bcr-abl1、cbfb-myh11和pml-rara融合基因的探针和引
物组合。
32.所述检测多种白血病融合基因的引物探针组合中，所述基因探针ae-p带有fam荧光报告基团、cbfb-p带有vic荧光报告基团、abl1-p带有ro荧光报告基团，rara-p带有cy5荧光报告基团。
33.所述检测多种白血病融合基因的引物探针组合还包括rpp30基因的检测引物和探针组合；
34.所述rpp30基因的检测引物探针组合包括：
35.rpp30基因正向引物r30-fr，其序列如seq:id no 18所示；
36.rpp30基因反向引物r30-rr，其序列如seq:id no 19所示；
37.rpp30基因探针p30-p，其序列如seq:id no 20所示；
38.所述探针p30-p连有a425荧光报告基团。
39.本发明还提供了一种检测多种白血病融合基因的试剂盒，其特征在于，包括所述的检测多种白血病融合基因的引物探针组合。
40.所述检测多种白血病融合基因的试剂盒还包括dna聚合酶和反应缓冲液。
41.本发明还提供了利用数字pcr检测多种白血病融合基因检测方法，所述检测的样品为人体的细胞组织。
42.所述检测方法的步骤为：
43.提取所述细胞组织的rna；将提取的rna转录为cdna；使用本发明提供的检测多种白血病融合基因的试剂盒对所得的cdna进行数字pcr；分析并判读pcr结果。
44.具体地，判读测试结果的方法为：
45.若fam荧光有信号值，则代表样品中存在aml1-eto融合基因；
46.若vic荧光有信号值，则代表样品中存在cbfb-myh11融合基因；
47.若ro荧光有信号值，则代表样品中存在bcr-abl1融合基因；
48.若cy5荧光有信号值，则代表样品中存在pml-rara融合基因；
49.本发明提供的试剂盒能检测aml1-eto、bcr-abl1-p190亚型、bcr-abl1-p210亚型、cbfb-myh11-a亚型、cbfb-myh11-d亚型、pml-rara-l亚型、pml-rara-s亚型和pml-rara-v亚型融合基因。当样品中只含有某种融合基因时，只会产生对应的荧光，不会进行非特异性扩增，具有良好的特异性。此外，本发明所提供的试剂盒在重复检测临床样品的过程中，其变异系数皆小于10％，具有良好的稳定性。因此，本发明提供的试剂盒有用于临床样品的多重白血病基因检测的价值。
具体实施方式
50.本发明提供了一种检测多种白血病融合基因的数字pcr试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
51.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
52.实施例1、制备白血病融合基因的多重数字pcr检测试剂盒
53.1.引物和探针的设计
54.依据aml1-eto、bcr-abl1(p190亚型、p210亚型、p230亚型)、cbfb-myh11(a亚型和d亚型)和pml-rara(l亚型、s亚型、v亚型)的融合基因的序列信息，选择内源性rpp30基因作为内参，分别针对每一种基因设计对应的引物及其检测探针。
55.引物探针根据所检测基因命名，“p/pr”代表探针，“f/fr”代表正向引物，“r”代表反向引物，每一种亚型都设计了对应引物，同一种基因的不同亚型使用同样的探针，具体信息如表1所示。
56.2、数字pcr试剂盒的组成
57.1)引物和探针。
58.按照表1所示的序列合成引物和探针，探针上带有相应的荧光基团。
59.2)ddpcr mix。
60.其包括pcr聚合酶、核苷酸混合液和反应缓冲液，所述成分皆来自于市售。
61.表1引物探针表
[0062][0063]
实施例2、数字pcr试剂盒检测临床样品
[0064]
1.样品
[0065]
所测样品来自于临床患者，阴性对照来自于健康人。用rna提取试剂盒提取所选组织样品的rna，做为待测样品，所述rna提取试剂盒为普通市售rna提取试剂盒。
[0066]
本实验所测的样品具体有：
[0067]
1)aml1-eto基因融合患者的rna样品
[0068]
2)bcr-abl1基因融合患者的rna样品，包括:
[0069]
bcr-abl1-p190亚型基因融合患者的rna样品
[0070]
bcr-abl1-p210亚型基因融合患者的rna样品bcr-abl1-p230亚型基因融合患者的rna样品
[0071]
3)cbfb-myh11基因融合患者的rna样品，包括：
[0072]
cbfb-myh11-a亚型基因融合患者的rna样品cbfb-myh11-d亚型基因融合患者的rna样品
[0073]
4)pml-rara基因融合患者的rna样品，包括：
[0074]
pml-rara-l亚型基因融合患者的rna样品pml-rara-s亚型基因融合患者的rna样品pml-rara-v亚型基因融合患者的rna样品
[0075]
5)阴性样品：来自健康人的口腔脱落细胞的rna样品。
[0076]
后续的样品根据其所对应的患者所含有的白血病融合基因命名，具体地，可以将上述样品分别命名为：aml1-eto、bcr-abl1-p190亚型、bcr-abl1-p210亚型、cbfb-myh11-a亚型、cbfb-myh11-d亚型、pml-rara-l亚型、pml-rara-s亚型、pml-rara-v亚型的rna样品，及阴性对照rna样品。
[0077]
2.反转录
[0078]
表2反转录体系表
[0079][0080]
将实施例2步骤1所述的rna样品分别进行反转录，获得对应的cdna样品。反转录的体系和程序如表2所示，其中rt buffer、rtase、depc处理水和随机引物均来自于普通市售的反转录试剂盒。
[0081]
3.数字pcr检测体系的配置
[0082]
本发明提供的试剂盒以及检测方法检测的样品为cdna，检测所用的体系如表3所示。
[0083]
表3数字pcr检测体系表
[0084][0085]
4.数字pcr检测样品
[0086]
用本发明实施例1中所提供多重数字pcr试剂盒，分别以aml1-eto、bcr-abl1-p190亚型、bcr-abl1-p210亚型、cbfb-myh11-a亚型、cbfb-myh11-d亚型、pml-rara-l亚型、pml-rara-s亚型、pml-rara-v亚型的rna样品，及阴性对照的rna样品转录所得的cdna样品为模板，分别配置pcr检测体系。然后将所述的检测体系按照表2中的扩增程序进行pcr扩增和荧光检测。
[0087]
同时，设置以超纯水为模板的数字pcr组为ntc(无模板对照组)。
[0088]
ntc组重复2次，aml1-eto组、bcr-abl1-p190亚型组、bcr-abl1-p210亚型组、cbfb-myh11-a亚型组、cbfb-myh11-d亚型组、pml-r ara-l亚型组、pml-rara-s亚型组、pml-rara-v亚型组和阴性对照组分别重复5次。
[0089]
检测结果如表4所示。
[0090]
表4检测结果表(单位：copies/μl)
[0091]
[0092]
[0093][0094]
5结论
[0095]
如表1所示，检测ntc组无非特异性扩增；
[0096]
检测阴性对照的rna，只能检测到内源性内参的a425信号，fam、vic、rox和cy5荧光信号都为0。且5次重复检测的变异系数cv都小于10％；
[0097]
检测aml1-eto组的cdna，能同时检测到fam和a425信号，vic、rox和cy5荧光信号都为0。且5次重复检测的变异系数cv都小于10％；
[0098]
分别检测bcr-abl1融合3种亚型的cdna样品，能同时检测到vic和a425信号，fam、rox和cy5荧光信号都为0。且5次重复检测的变异系数cv都小于10％；
[0099]
分别检测cbfb-myh11融合2种亚型的cdna样品，能同时检测到rox和a425信号，fam、vic和cy5荧光信号都为0。且5次重复检测的变异系数cv都小于10％；
[0100]
分别检测pml-rara融合3种亚型的样品，能同时检测到rox和a425信号，fam、vic和cy5荧光信号都为0。且5次重复检测的变异系数cv都小于10％。
[0101]
以上测试说明本发明的检测体系无论是特异性，还是稳定性都比较好。本发明在检测分别只含有aml1-eto、bcr-abl1-p190亚型、bcr-abl1-p210亚型、cbfb-myh11-a亚型、cbfb-myh11-d亚型、pml-rara-l亚型、pml-rara-s亚型或pml-rara-v亚型基因中的一种的样品时，只会产生对应的荧光，不会进行非特异性扩增，特异性良好。而且本发明所提供的试剂盒在检测相同的样品过程中，其变异系数皆小于10％，特异性良好。本发明提供的试剂和盒有用于临床样品的多重白血病基因检测的价值。
[0102]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。